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Natura volume 617, pagine 711–716 (2023) Citare questo articolo

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La microscopia a fluorescenza, con la sua specificità molecolare, è uno dei principali metodi di caratterizzazione utilizzati nelle scienze della vita per comprendere i sistemi biologici complessi. Gli approcci a super-risoluzione1,2,3,4,5,6 possono raggiungere una risoluzione in cellule nell'intervallo da 15 a 20 nm, ma le interazioni tra singole biomolecole si verificano su scale di lunghezza inferiori a 10 nm e la caratterizzazione della struttura intramolecolare richiede la risoluzione di Ångström. Le implementazioni all'avanguardia della super risoluzione7,8,9,10,11,12,13,14 hanno dimostrato risoluzioni spaziali fino a 5 nm e precisione di localizzazione di 1 nm in determinate condizioni in vitro. Tuttavia, tali risoluzioni non si traducono direttamente in esperimenti su cellule e la risoluzione di Ångström non è stata dimostrata fino ad oggi. Qui introduciamo un metodo di codifica a barre del DNA, miglioramento della risoluzione mediante imaging sequenziale (RESI), che migliora la risoluzione della microscopia a fluorescenza fino alla scala di Ångström utilizzando hardware e reagenti per microscopia a fluorescenza standard. Imaging sequenziale di sottoinsiemi di target sparsi a risoluzioni spaziali moderate di> 15 nm, dimostriamo che la risoluzione di una singola proteina può essere ottenuta per biomolecole in cellule intere intatte. Inoltre, risolviamo sperimentalmente la distanza della spina dorsale del DNA di singole basi negli origami di DNA con risoluzione Ångström. Utilizziamo il nostro metodo in una dimostrazione di prova di principio per mappare la disposizione molecolare del bersaglio CD20 dell'immunoterapia in situ in cellule non trattate e trattate con farmaci, il che apre possibilità per valutare i meccanismi molecolari dell'immunoterapia mirata. Queste osservazioni dimostrano che, consentendo l’imaging intramolecolare in condizioni ambientali di cellule intere intatte, RESI colma il divario tra la microscopia a super risoluzione e gli studi di biologia strutturale e fornisce quindi informazioni fondamentali per comprendere i sistemi biologici complessi.

La precisione di localizzazione (σSMLM) di una molecola bersaglio nella microscopia di localizzazione di singola molecola ad ampio campo (SMLM)15 è in definitiva e fondamentalmente limitata dal numero di fotoni (N) raccolti per evento di lampeggiamento: \({\sigma }_{{\rm {SMLM}}}\about \frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\) (σDIFF è la sd della funzione di diffusione dei punti (PSF) del sistema ottico sistema di imaging16; Fig. 1a). Localizzazioni multiple dello stesso target (Fig. 1b, in alto) sono distribuite attorno alla posizione reale a causa della loro precisione finita. Due o più punti non risolvibili da SMLM producono distribuzioni sovrapposte di localizzazioni, precludendo così l'assegnazione univoca delle localizzazioni ai rispettivi obiettivi (Fig. 1b, in basso). Tuttavia, se ciascuna localizzazione potesse essere assegnata a un target specifico tramite colore, codice a barre o qualsiasi altra identità molecolare, questi potrebbero essere raggruppati in modo inequivocabile per target2.

a, In SMLM, σSMLM di un singolo colorante scala con \(\frac{{\sigma }_{{\rm{DIFF}}}}{\sqrt{N}}\), limitando in definitiva la risoluzione spaziale ottenibile. b, gli approcci SMLM come DNA-PAINT presentano una risoluzione spaziale di circa 10 nm (risoluzione approssimata come larghezza intera a metà massimo ≈ 2,35 σSMLM). Mentre i target separati da 20 nm (d1) possono quindi essere risolti di routine, gli oggetti distanziati di 2 nm (d2) sono irrisolvibili perché le risultanti distribuzioni delle localizzazioni si sovrappongono. c, utilizzando sequenze di DNA ortogonali (blu e verde) e acquisizione sequenziale come in Exchange-PAINT, è possibile assegnare in modo inequivocabile per ciascun target le localizzazioni da target distanziati più ravvicinati rispetto al limite di risoluzione SMLM. d, La combinazione di tutte le localizzazioni per target (K) per ogni ciclo di imaging migliora la precisione della localizzazione da sd (σSMLM) a sem (σRESI). e, Poiché la super-risoluzione ha rivoluzionato la microscopia a fluorescenza, RESI si traduce in un altro cambiamento di paradigma riapplicando il concetto di localizzazione ai dati in super-risoluzione. f, La precisione di localizzazione nelle scale RESI con \(\frac{1}{\sqrt{K}}\), e quindi il miglioramento della risoluzione in RESI è indipendente da σSMLM, raggiungendo la precisione di localizzazione sulla scala Ångström.